Мембранно-ассоциированная тиаминкиназа из головного мозга свиньи: распределение в субклеточных фракциях и отделах, аминокислотный состав

Abstract

Введение. Тиаминкиназа – фермент медицинского назначения, генетически детерминированные «поломки» при синтезе которого приводят к ряду нейродегенеративных заболеваний. Знание распределения фермента в компартментах мозга, регуляторных возможностей глобулы в образовании коферментной формы витамина В1 – тиаминдифосфата – позволит вести направленную коррекцию патологических состояний. Цель. Выяснить локализацию фермента в мозге свиньи, роль гидрофобных и гидрофильных взаимодействий в ассоциации на мембранах, природу аминокислотных остатков, определяющих структуру белка. Материал и методы. Для получения мембран свежий очищенный от оболочек и сосудов мозг измельчали, заливали четырьмя объемами охлажденного трис-HCl буфера (50 мМ, рН 7,4) с 0,2 мМ ЭДТА и гомогенизировали (2000 об•мин–1) 5 циклами. Гомогенат центрифугировали (60 минут при 30000 g), супернатант отбрасывали, оставшиеся в осадке мембраны подвергали солюбилизации исходным буфером, содержащим в своем составе 0,05-1% детергенты. Активность фермента оценивали по скорости образования тиаминдифосфата. Гидролиз белка осуществляли в вакуумированных ампулах с 6 М HCl при 110°С в течение 18, 22, 48 и 72 часов. Изоэлектрическую точку (р1) рассчитывали по аминокислотному составу и с помощью метода изоэлектрофокусирования. Изоионную точку находили посредством диализа тиаминкиназы с последующим измерением рН в диализате. Результаты. Установлено, что гидрофобные детергенты обладают более выраженным солюбизирующим эффектом по сравнению с гидрофильными. При высоких значениях критической концентрации мицелообразования (1%) и те и другие изменяют конформационное состояние макромолекулы, влияя на ее сродство к субстратам и эффекторам. Тиаминкиназа достаточно равномерно рассредоточена во всех отделах мозга, однако субклеточная локализация разная. Наибольшая ферментативная активность прослеживается в митохондриальных фракциях. Фермент характеризуется повышенной концентрацией аминокислот, способствующих α-спирализации белковой глобулы при одновременно низком содержании остатков, связывающих полипептидные цепи и высоком – осуществляющих их резкий поворот на 130°, несовместимый с ходом α-спирали. Выводы. Тиаминкиназа головного мозга – мембранно-ассоциированный белок. Во взаимодействии с липидным бислоем мембран задействованы в основном гидрофобные силы. В зависимости от концентрации детергента процесс солюбилизации сопровождается изменением конформации глобулы. Основное количество тиаминкиназы сосредоточено в митохондриальных мембранах.