Ферментные системы биотрансформации активных форм витамина В1 (структура, свойства, регуляция)

Abstract

На синтезированных аффинных сорбентах, содержащих в качестве лиганда ТДФ, впервые до гомогенного состояния осуществлена очистка препаративных количеств Т-киназы, позволившая изучить её структурную организацию к физико-химические свойства. Показано, что в клетках дрожжей энзим представлен ассоциирующе-диссоциирующей системой олигомеров, на состояние равновесия которых влияют условия среды, концентрации тиамина, субстратов де-гидрогеназ с-кетокислот, дикарбоновых кислот цикла Кребса. Индуцируемые лигандами изменения носят временный характер и являются регуляторным фактором скорости образования фосфатов витамина. Предложена модель организации активного центра Т-киназы, где важная роль во взаимодействии тиамина и АТФ отводится двухвалентным катионам, вызывающим локальные перестройки молекулы фермента. Проведен сравнительный анализ кинетики и свойств белка пивных дрожжей и мозга быка. Впервые в индивидуальном состоянии получен препарат ТДФ-киназы, катализирующий биосинтез трифосфорного эфира тиамина. Установлено, что белок из пивных дрожжей синтезирует ТТФ из свободного, не связанного с гипотетическим белком-носителем ТДФ, и не требует для активации процесса присутствия глюкозы. Охарактеризованы молекулярно-кинетические параметры, структура, субстратная специфичность, механизм действия фермента. Найдено, что аналогично Т-киназе ТДФ-киназа дрожжей представлена множественными формами и олигомерной структурой, подверженной аллостерическому воздействию субстратов и ионов металлов. Определён молекулярный вес субъединиц, условия обуславливающие их ассоциативно-диссоциативное взаимодействие. Показана возможность регуляции активности ТДФ-киназы ЛТФ, тиамином и его аналогами. Приведены новые данные о количественном содержании ди- и трифосфорного эфиров тиамина в клетках и культуральной жидкости пивных дрожжей и гепатоцитах крыс. Доказано, что принципиальная схема реакции синтеза ТТФ в дрожжах аналогична таковой в тканях млекопитающих. Впервые предложена методика выделения электрофоретически гомогенной ТТФ-азы, энзима гидролиза ТТФ. Установлено, что фермент из мозга быка состоит из одной полипептидной цепи и обладает абсолютной специфичностью к трифосфорному эфиру. Изучены его кинетические свойства, механизм действия, возможные пути регуляции в клетке, взаимодействие с субстратом. Впервые сформулировано представление о растворимой ТТФ-азе как периферическом мембранном белке и универсальной роли ТТФ в транспорте ионов. Доказано наличие двух взаимопревращающихся кинетических форм ТТФ-азы, характеризующихся различными активностями, сродством к субстрату и энергиями активации. Выяснено, что связывание с ферментом осуществляется за счет фосфорнокислого остатка ТТФ, а взаимодействие тиаминовой части молекулы с каталитическим участком активного центра приводит к правильной ориентации и гидролизу субстрата. Важная роль в процессе катализа принадлежит аминогруппе пиримидинового кольца, гидрофобна контактам и четвертичному азоту тиазола. Установлены вероятные пути регуляции скорости гидролиза ТТФ аденозинтрифосфатом и свободными ионами Mg. Впервые исследована активность ферментов синтеза и деградации 5 активных форм тиамина в норме, B1-гиповитаминозных состояниях и рассмотрена роль каждой белковой молекулы в формировании внутриклеточного пула витамина. Определены эакономерности изменения и направленность потока тиаминфосфатов в условиях нарушения адаптационных и гомеостатических возможностей организма.