Выделение и радиометрический метод определения активности АТР: тиаминдифосфатфосфотрансферазы из митохондрий головного мозга свиньи

Abstract

Введение. Назначение и биологические пути регуляции уровня трифосфорного эфира тиамина в клетке остаются невыясненными. Связано это с отсутствием надёжной методологической основы оценки активности фермента биосинтеза метаболита – АТР: тиаминдифосфатфосфотрансферазы (КФ 2.7.4.15). Цель. Разработать адекватный способ разделения ингредиентов трансферазной реакции, выделить частично очищенный препарат фермента. Материал и методы. В качестве субстрата использовался экзогенный, полученный нами, 14С – тиаминдифосфат. Образовавшийся продукт – трифосфорный эфир тиамина – отделяли ионообменной хроматографией. Результаты. Из митохондриальной фракции головного мозга свиньи выделен частично очищенный препарат трансферазы с выходом 14,2%. Установлено, что максимальная ферментативная активность проявляется при pH 7,0-8,5, концентрациях тиаминдифосфата 2,5 – 3,0∙10-5 М. Выводы. Предложенный изотопный метод обладает достаточной чувствительностью и позволяет фиксировать АТР: тиаминдифосфатфосфо-трансферазную активность в субклеточных фракциях мозга.