Тест-система для проведения ПЦР в режиме реального времени для обнаружения ДНК ТТV в биологическом материале

Abstract

Введение. Исследование биологического материала на наличие ДНК TTV методом ПЦР позволяет своевременно оценить функциональное состояние печени и иммунной системы человека. Цель исследования – создание компонентов для проведения ПЦР в режиме реального времени для обнаружения ДНК TTV в биологическом материале. Материал и методы. Проведены конструирование и подбор оптимальных праймеров и зондов с учетом размера (длины) ампликона, температуры отжига, нуклеотидного состава, распределения нуклеотидов по длине праймера, длины праймеров; возможности образования праймерами шпилек и димеров определяли с помощью программ Primer-BLAST/Primer3, FastPCR. Поскольку праймеры, даже абсолютно уникальные для тех или иных последовательностей ДНК, могли отжигаться и на неспецифичных участках, не относящихся к анализируемому гену, нами выполнялась проверка соответствия праймеров последовательностям целевого гена. С этой целью использовали online сервис NCBI Primer BLAST и оценивали локальное попарное выравнивание каждого из праймеров со всеми нуклеотидными последовательностями баз данных Refseq. Результаты. В результате проведенных исследований по подбору оптимальной температуры отжига праймеров, концентраций праймеров, а также подбору оптимальной пары нуклеотидов были определены основные параметры сконструированных праймеров. Выводы. Создан набор для обнаружения и количественной оценки ДНК TTV методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, который стал основой для разработки коммерческой тест-системы.